중첩 PCR (nested PCR)
쉽게 풀면
표적 DNA가 아주 적으면 한 번의 증폭으로는 신호가 잡히지 않거나 엉뚱한 산물이 함께 늘어납니다. 중첩 PCR은 먼저 넓은 범위를 한 번 증폭한 뒤, 그 산물을 주형으로 삼아 안쪽에 붙는 새 프라이머 쌍으로 다시 증폭하는 방법입니다. 1차에서 우연히 생긴 비특이 산물에는 2차 프라이머가 붙을 자리가 없기 때문에, 감도와 특이도가 동시에 올라갑니다. 미량 병원체 검출이나 오래된 시료 분석에 유용합니다.
왜 중요한가
임상 검체나 환경 시료에는 표적이 극히 적게 들어 있는 경우가 많고, 억제 물질 때문에 증폭 효율도 떨어집니다. 중첩 PCR은 장비를 추가하지 않고도 검출 한계를 크게 낮출 수 있어 오랫동안 미량 검출의 실용적 해법으로 쓰여 왔습니다.
논문에서는 이렇게 쓰입니다
두 번에 걸쳐 증폭함으로써 검출 한계를 낮췄다는, 이 기법의 목적을 그대로 보여주는 서술입니다.
조금 더 깊게 보면
2차 프라이머는 1차 산물의 내부에 위치해야 하며, 양쪽 모두 안쪽으로 옮기는 방식과 한쪽만 옮기는 반중첩 방식이 있습니다. 가장 큰 문제는 1차 산물이 든 튜브를 열어 옮기는 과정에서 생기는 교차 오염이며, 증폭된 DNA는 농도가 매우 높아 미세한 비말도 다음 실험을 망칠 수 있습니다. 그래서 작업 공간과 기구를 물리적으로 분리하고, 한 튜브 안에서 온도 조건을 달리해 두 단계를 이어서 수행하는 단일 튜브 방식이 대안으로 쓰입니다. 정량 목적보다는 있는지 없는지를 판정하는 정성 검출에 주로 사용됩니다.
주의할 점
두 단계를 거치면서 증폭 편향이 커져 정량 결과를 신뢰하기 어렵고, 오염에 의한 거짓 양성 위험이 높아 음성 대조를 충분히 두어야 합니다. 다중PCR이 한 반응에서 여러 표적을 동시에 증폭하는 방법이라면, 이 항목은 하나의 표적을 두 번에 걸쳐 증폭해 감도를 높이는 방법입니다.