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트립판 블루 배제법 (Trypan Blue Exclusion Assay)

쉽게 풀면

트립판 블루라는 파란색 염색약은 분자 크기가 커서 정상적인 세포막을 통과하지 못한다. 하지만 죽은 세포는 세포막이 손상되어 있어 이 염색약이 세포 안으로 들어가 세포 전체가 파랗게 물든다. 반대로 살아있는 건강한 세포는 염색약을 막아내 원래의 투명한 색을 그대로 유지한다. 이 색 차이를 현미경으로 눈으로 구분해가며 살아있는 세포와 죽은 세포의 비율을 계산하면 시료의 생존율을 알 수 있다.

왜 중요한가

세포 생존율은 세포 배양, 독성 평가, 약물 반응 실험 등 실험세포생물학 전반에서 실험 결과의 해석 기반이 되는 기초 지표입니다. 처리군과 대조군의 생존율을 비교하는 과정이 논문의 핵심 결과로 이어지는 경우가 많아, 이를 어떤 방법으로 측정했는지가 실험의 신뢰성을 뒷받침하는 근거로 자주 명시됩니다.

어떤 절차인가

1. 세포 부유액과 0.4% 트립판 블루 용액을 같은 부피로 섞습니다(희석 배수 2). 실온에 두고 보통 3~5분 안에 셉니다(Strober 2001). 오래 두면 살아 있던 세포도 염색되기 시작해 생존율이 낮게 나옵니다.
2. 혈구계산판(혈구계산판)에 10 μL 정도를 넣고 현미경으로 봅니다.
3. 파랗게 물든 세포는 죽은(막이 손상된) 세포, 물들지 않고 빛나 보이는 세포는 산 세포로 셉니다.
4. 생존율(%) = 산 세포 수 ÷ (산 세포 + 죽은 세포 수) × 100. 세포 농도는 산 세포 수의 평균에 희석 배수와 10⁴를 곱해 구합니다(큰 칸 1개의 부피가 10⁻⁴ mL).

언제 쓰고 무엇을 얻나

• 언제 쓰나: 계대 배양 전 세포 수와 상태 확인, 약물·독성 처리 후 막 손상 정도 확인, 실험(트랜스펙션, 동결 해동 후)에 쓸 세포가 충분히 건강한지 확인할 때입니다.
• 얻는 것: 막 완전성(membrane integrity)에 기반한 ‘죽은 세포’ 비율입니다. 가장 간단하고 값싼 방법입니다.
• 한계: 막이 아직 온전한 초기 세포자멸사 세포는 산 세포로 셉니다. 또 막이 손상된 세포만 잡으므로 ‘대사 활성이 있는지’를 보는 MTT 시험과는 다른 정보입니다. 세포 응집, 찌꺼기, 혈청 단백질(트립판 블루가 결합함)도 판독을 방해하므로 무혈청 완충액에 풀어 세는 것이 권장됩니다.

계산 예(가상의 값). 큰 칸 4곳에서 산 세포 47, 45, 50, 46개(합 188), 죽은 세포 3, 2, 4, 3개(합 12)를 셌고, 세포와 염색액을 1:1로 섞었습니다(희석 배수 2).

1. 생존율 = 188 ÷ (188 + 12) × 100 = 188 ÷ 200 × 100 = 94%.
2. 산 세포 평균 = 188 ÷ 4 = 47개/칸.
3. 산 세포 농도 = 47 × 2 × 10⁴ = 9.4 × 10⁵ cells/mL. (죽은 세포까지 합친 전체 농도는 50 × 2 × 10⁴ = 10.0 × 10⁵ cells/mL.)

논문에는 이렇게 적는다

• 염색액의 종류와 농도(예: 0.4% 트립판 블루), 세포와 섞은 비율, 염색 후 센 시점을 적습니다.
• 계수 방법(혈구계산판인지 자동 계수기인지)과 센 칸 수, 반복 횟수를 적고, 생존율은 평균 ± 표준편차로 제시합니다.
• “생존율이 90% 이상인 배양만 실험에 사용했다”처럼 기준을 쓸 때는 그 기준이 연구실의 관례임을 밝히고, 처리군과 대조군을 같은 방식으로 셌는지 명시합니다.

논문에서는 이렇게 쓰입니다

실제 논문에서

이 용어를 직접 쓴 국내 논문 문장을 아직 수집하지 못했습니다. 수집되는 대로 출처와 함께 싣겠습니다.

예시 문장

아래는 용어의 쓰임을 보여 주려고 만든 예시로, 실제 논문에서 가져온 문장이 아닙니다.

파랗게 염색된 죽은 세포와 염색되지 않은 살아있는 세포의 비율을 세어 생존율을 계산했다는 뜻이다.

독성평가나 약리학 연구에서 특정 약물 처리가 세포 생존에 미치는 영향을 이 방법으로 확인했다는 의미다.

세포 배양 실무에서 다음 계대를 위한 세포 수를 정확히 맞추기 위해 이 방법을 사용했다는 뜻이다.

조금 더 깊게 보면

이 방법은 육안 계수에 의존하기 때문에 관찰자 간 편차가 생길 수 있어, 최근에는 자동 세포계수기를 이용해 일관성을 높이는 경우가 많습니다.

또한 트립판 블루는 세포막 손상 여부만 확인할 뿐 세포 사멸 초기 단계(예: 아폽토시스 초기)는 놓칠 수 있어, 더 정밀한 생존율 평가가 필요할 때는 플로우 사이토메트리 기반의 형광 염색법을 함께 사용하기도 합니다.

생존율은 흔히 (살아있는 세포 수) ÷ (전체 세포 수) × 100으로 계산하며, 세포 농도가 너무 높으면 서로 겹쳐 보여 계수 오차가 커지므로 적절한 희석 배율로 맞춘 뒤 측정하는 것이 일반적입니다.

주의할 점

보통 혈구계산판이나 자동 세포계수기와 함께 사용되어 세포 수 계수와 생존율 판별을 동시에 수행하는 경우가 많다.

헷갈리기 쉬운 용어

세포 ‘생존’을 재는 방법은 무엇을 보는지가 서로 다릅니다.

참고 문헌

1. Strober, W. (2001). Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology, Appendix 3B.
2. Tennant, J. R. (1964). Evaluation of the trypan blue technique for determination of cell viability. Transplantation, 2(6), 685–694.
3. Louis, K. S., & Siegel, A. C. (2011). Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods. Methods in Molecular Biology, 740, 7–12.
4. Freshney, R. I. (2016). Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications (7th ed.). Wiley-Blackwell.

표의 기준값은 위 문헌에 근거한 관례이며, 분야·학술지마다 다른 기준을 쓸 수 있습니다.

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