CRISPR 표적 이탈 효과 (Off-Target Effect in CRISPR)

한 줄 정의: CRISPR-Cas9 시스템이 의도한 표적 서열이 아닌 유전체의 다른 위치를 절단하는 의도치 않은 편집 현상입니다.

쉽게 풀면

가이드 RNA는 목표 서열과 완전히 일치하는 곳뿐 아니라, 몇 개의 염기만 다르고 나머지가 비슷한 곳에도 어느 정도 결합할 수 있습니다. 이런 유사 서열에서 Cas9이 절단을 일으키는 것이 표적 이탈 효과입니다. 내비게이션이 목적지 주소와 비슷한 다른 주소로 잘못 안내하는 것에 비유할 수 있습니다. 이 오류는 원치 않는 유전자 손상이나 돌연변이로 이어질 수 있어 CRISPR 기술의 안전성 평가에서 핵심적으로 다뤄집니다.

왜 중요한가

치료 목적의 유전체 편집에서 표적 이탈 편집은 종양 억제 유전자를 손상시키거나 예측하지 못한 부작용을 유발할 위험이 있어, 임상 적용 전 반드시 확인해야 하는 안전성 지표입니다. 따라서 이를 줄이거나 검출하는 방법을 개발하는 연구가 CRISPR 관련 논문에서 큰 비중을 차지합니다.

핵심 정리

SpCas9은 가이드 RNA(약 20개 염기)와 상보적인 DNA 서열을 찾고, 그 옆에 PAM(5′-NGG-3′)이 있을 때 절단합니다(가이드 RNA와 CRISPR-Cas9 문서 참조).
그런데 가이드와 염기가 몇 개 다른 서열에도 결합해 절단할 수 있습니다. Fu 외(2013)는 사람 세포에서 최대 5개 위치가 다른 서열에서도 표적과 비슷한 빈도로 돌연변이가 생길 수 있음을 보고했고, Hsu 외(2013)는 불일치의 개수, 위치, 분포에 따라 허용 정도가 달라진다고 보고했습니다.
일반적으로 PAM에 가까운 쪽(씨앗 영역)의 불일치는 덜 허용되고, PAM에서 먼 쪽의 불일치는 더 잘 허용되는 경향이 있습니다.
그래서 표적 이탈(off-target) 효과는 절단 부위를 예측하는 도구, 세포에서 실제 절단 부위를 찾는 방법(GUIDE-seq, Tsai 외, 2015), 전장 유전체 서열 분석으로 확인하고, 정확도를 높인 변이 Cas9(Kleinstiver 외, 2016) 등으로 줄입니다.

예시로 보기

후보 부위가 얼마나 많은지 계산으로 가늠해 봅니다. 20개 염기의 가이드와 k개 이하로 다른 서열의 가짓수는 Σ C(20, i)·3ⁱ(i = 0…k)입니다(코드로 계산).

허용 불일치	가능한 서열 수	무작위 서열 가정 시 사람 유전체에서 기대되는 후보 부위 수
0개	1	—
3개 이하	32,551	약 11
4개 이하	424,996	약 150
5개 이하	4,192,468	약 1,500

세 번째 열은 유전체(약 31억 염기쌍, 두 가닥)가 무작위 서열이라고 가정하고, NGG PAM이 붙을 확률 1/16을 곱해 계산한 값입니다. 실제 유전체는 반복 서열이 많고 무작위가 아니며, 불일치 부위가 모두 절단되는 것도 아니므로 이 값은 후보의 규모감일 뿐입니다. 그래도 불일치를 몇 개만 허용해도 후보가 수십~수백 곳으로 늘어난다는 점은 표적 이탈을 따로 검사해야 하는 이유를 보여 줍니다.

자주 하는 오해

가이드 설계만 잘하면 해결되는 문제가 아닙니다. Cas9 단백질이 세포 안에 머무는 시간과 양도 영향을 줍니다. 그래서 플라스미드 대신 단백질-RNA 복합체(RNP)를 짧게 전달하는 방법을 쓰기도 합니다.
예측 도구에서 이탈 부위가 안 나왔다고 안전한 것은 아닙니다. 예측은 서열 유사성에 기반하므로 놓치는 경우가 있고, 실제 세포에서의 검출(GUIDE-seq 등)과 서열 분석으로 확인합니다.
표적 이탈과 표적 안의 의도치 않은 변화는 다릅니다. 표적 부위 자체에서도 큰 결실이나 복잡한 재배열이 생길 수 있다는 보고가 있습니다(Kosicki 외, 2018). 안전성 평가에서는 둘 다 봐야 합니다.
“표적 이탈은 없었다”는 문장은 검출 한계와 함께 읽어야 합니다. 검사 방법의 민감도 안에서 발견되지 않았다는 뜻이지 절대적으로 없다는 뜻이 아닙니다.

논문에서는 이렇게 쓰입니다

실제 논문에서

이 용어를 직접 쓴 국내 논문 문장을 아직 수집하지 못했습니다. 수집되는 대로 출처와 함께 싣겠습니다.

예시 문장

아래는 용어의 쓰임을 보여 주려고 만든 예시로, 실제 논문에서 가져온 문장이 아닙니다.

"Whole-genome sequencing revealed no detectable off-target effects at the top ten predicted sites."

전장 유전체 서열분석을 통해 예측된 상위 10개 부위에서 표적 이탈 효과가 검출되지 않았음을 확인한 결과를 설명합니다.

"High-fidelity Cas9 variants were employed to minimize off-target effects while maintaining on-target editing efficiency."

고정밀 Cas9 변이체를 사용하여 표적 편집 효율은 유지하면서 표적 이탈 효과를 최소화했다는 내용입니다.

조금 더 깊게 보면

표적 이탈은 가이드 RNA와 유사 서열 간 염기 불일치 개수와 위치, PAM 서열의 존재 여부 등에 영향을 받습니다. 이를 예측하기 위한 전산 알고리즘과 함께, GUIDE-seq나 전장 유전체 서열분석 같은 실험적 검출 방법이 함께 사용됩니다. 표적 특이성을 높인 고정밀 Cas9 변이체나 절단 활성을 조절한 니카아제 방식도 표적 이탈을 줄이는 전략으로 연구됩니다.

주의할 점

표적 이탈 효과는 세포 유형, 가이드 RNA 설계, 검출 방법에 따라 결과가 달라질 수 있어, 특정 조건에서 검출되지 않았다고 해서 완전히 없다고 단정할 수는 없습니다.

헷갈리기 쉬운 용어

편집 결과가 ‘의도와 다른’ 경우는 위치와 원인에 따라 나뉩니다.

용어	어디서 생기나	설명
표적 효과(on-target)	의도한 표적 서열	원하는 편집. 효율과 정확성을 평가
표적 이탈(off-target)	표적과 비슷한 다른 서열	가이드와 불일치가 있는 곳에서 절단
표적 내 의도치 않은 변화	의도한 표적 부위	큰 결실이나 재배열처럼 예상 밖의 수선 결과
구경꾼 편집(bystander)	표적 근처의 같은 염기	염기편집기가 창(window) 안의 인접 염기까지 바꾸는 경우

참고 문헌

Fu, Y., Foden, J. A., Khayter, C., Maeder, M. L., Reyon, D., Joung, J. K., & Sander, J. D. (2013). High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nature Biotechnology, 31, 822–826.
Hsu, P. D., Scott, D. A., Weinstein, J. A., et al. (2013). DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology, 31, 827–832.
Tsai, S. Q., Zheng, Z., Nguyen, N. T., et al. (2015). GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases. Nature Biotechnology, 33, 187–197.
Kleinstiver, B. P., Pattanayak, V., Prew, M. S., et al. (2016). High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects. Nature, 529, 490–495.
Kosicki, M., Tomberg, K., & Bradley, A. (2018). Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements. Nature Biotechnology, 36, 765–771.

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